Automatische genetische Analytik

Automatische genetische Analytik......Page 6
Vorwort......Page 8
Geleitwort......Page 10
Inhalt......Page 12
1.1 Was hat die DNA-Analyse so populär gemacht?......Page 20
1.2 Methodische Quantensprunge machten die DNA „reif“ für die Routineanalyse......Page 22
1.3.1 Teilbereiche der molekularen DNA-Analyse......Page 23
1.3.2 Das Konzept der Integration......Page 24
2.2 Vektoren für die DNA-Präparation......Page 26
2.4.1 Alkalische Lyse......Page 28
2.4.3 Aufreinigung der Plasmid-DNA über Säulen......Page 29
2.6 Molekularbiologische Workstation......Page 31
2.8 Literatur......Page 36
3.1 PCR – das Grundprinzip......Page 38
3.2 Automatisierung der PCR......Page 41
3.3.1 Reaktionsparameter......Page 43
3.3.2 Optimierungsstrategien......Page 47
3.4 Optimierung der Amplifikationspräzision......Page 48
3.5.1 Touchdown-PCR......Page 49
3.5.2 Nested-PCR......Page 50
3.5.3 Hot-Start-Technik......Page 51
3.6 Thermostabile Enzyme......Page 52
3.6.1 Taq-DNA-Polymerase......Page 53
3.6.2 rTth -DNA-Polymerase......Page 54
3.6.5 UITma™ DNA-Polymerase......Page 55
3.7 PCR und Kontaminationen......Page 56
3.8 Analyse der Amplifikationsprodukte......Page 57
3.8.1 Gelelektrophorese......Page 58
3.8.3 Kapillar-Elektrophorese (CE)......Page 59
3.8.4 TaqMan™-Assay zur Analyse von PCR-Produkten......Page 60
3.9 Literatur......Page 62
4.2 Chemische Grundlagen der DNA-Synthese......Page 64
4.3.1 Detritylierung......Page 67
4.3.2 Monomeraddition......Page 68
4.4 Automatisierung der DNA-Synthese......Page 69
4.6 Aufarbeitung von Oligonukleotiden......Page 71
4.6.1 Gelelektrophorese......Page 72
4.6.2 High Performance Liquid Chromatographie (HPLC)......Page 74
4.7 Mögliche Konsequenzen der Verwendung nichtgereinigter Oligonukleotide auf spätere Anwendungen......Page 77
4.8.1 Biotin-Markierung......Page 78
4.8.2 Phosphorylierung......Page 79
4.8.3 Fluoreszenzmarkierung......Page 80
4.10 Literatur......Page 81
5.2.1 Maxam-Gilbert-Sequenzierung......Page 84
5.2.2 Sequenzierung nach Sanger......Page 85
5.2.3 „Cycle-Sequenzierung“......Page 87
5.3.1 Phagen und Phagemide......Page 89
5.3.2 Plasmide und Cosmide......Page 90
5.3.4 Magnetic Beads......Page 91
5.4.1 Sequenzierung mit markierten Primern......Page 92
5.4.2 Sequenzierung mit markierten Desoxynukleotiden......Page 93
5.4.4 Nachträgliche Sequenz-Markierung......Page 94
5.5 Der Weg zur vollständigen Sequenz......Page 95
5.5.1 Geringer Aufwand für die Probenvorbereitung......Page 96
5.5.2 Kurze Analysezeiten rnit hoher Genauigkeit......Page 97
5.5.3 Hohe Leseweiten......Page 98
5.5.5 Detektionsverfahren......Page 102
5.6 Datendarstellung......Page 103
5.7 Literatur......Page 105
6.1 Einführung in die DNA-Fragmentanalyse......Page 106
6.2.1 Fluoreszenzmarkierte Primer......Page 108
6.2.2 Markierung mit fluoreszenzmarkierten dNTPs......Page 110
6.2.3 Markierung von dsDNA rnit Fluoreszenzdimeren (Interkalatoren)......Page 111
6.3 Exakte Längenbestimmung mit Hilfe eines internen Langenstandards......Page 113
6.5 Automatische Datenanalyse......Page 116
6.6 Quantitative Anwendungen in der Fragmentanalyse......Page 117
6.7.1 Die Identifizierung von Mutationen......Page 119
6.7.3 Multiplex-PCR für die Detektion von Deletionen......Page 121
6.7.4 Detektion von Punktmutationen......Page 122
6.7.5 Vergleich und Bewertung der verschiedenen Mutations-Detektions-Methoden......Page 127
6.8 Kopplungsanalysen......Page 128
6.9 STR-Analysen in der forensischen Spurenkunde......Page 132
6.10 Automatische genetische Analyse in der Landwirtschaft......Page 136
6.11 Literatur......Page 142
7.2 Die Ausgangssituation: Monomarkersysteme auf der Basis radioaktiver Nuklide oder einzelner Fluorochrome zur Detektion von DNA-Fragmenten......Page 146
7.2.2 Chemilumineszenz......Page 147
7.2.3 Fluorescein- und Rhodaminderivate, Ethidiumbromid, TOTO TM......Page 148
7.2.4 Detektion von Emissionsstrahlung bei nichtradioaktiven Monomarkersystemen......Page 149
7.2.5 Datenerfassung und -interpretation......Page 150
7.3 Multimarkersysteme auf der Basis von Fluoreszenzfarbstoffen zur Detektion von DNA-Fragmenten......Page 152
7.3.1 Das Systemkonzept......Page 153
7.3.2 Chemische Struktur und physikalische Grundlagen der Fluorophore: Absorption, Emission und Empfindlichkeit......Page 155
7.4 Laser-(Scanning-)Technologie als Grundlage eines Multimarker-Detektionssystems......Page 157
7.4.1 Grundlagen der „On-line“-Detektion von Multimarkersystemen......Page 158
7.4.2 Das Systemkonzept der Laser-Scanning-Technologie: Der Aufbau einer Multimarker-DNA-Analysestation mit hoher Kapazität......Page 159
7.4.3 Das Systemkonzept der Laserdetektion bei der Multimarker-DNA-Analyse in Kapillaren......Page 162
7.5 Variable Medien und Gellangen: Die vielseitigen Möglichkeiten der Elektrophorese mit „On-line“- Detektion......Page 164
7.6 Perspektiven in der Detektionstechnologie......Page 166
7.7 Literatur......Page 167
8.1.1 Integration......Page 168
8.1.3 Flexibilität......Page 169
8.2.1 Datenvisualisierung......Page 170
8.2.2 Dateneditierung......Page 172
8.2.3 Datenanalyse......Page 173
8.2.3.1 Sequenzalignment und Homologieanalysen......Page 175
8.2.3.3 Datenbanksuche......Page 176
8.2.3.5 Analyse des Informationsgehalts von DNA-Sequenzen......Page 177
8.2.4 Datenarchivierung/Datenbanken......Page 178
8.3 Spezifische Anforderungen bei der Analyse von DNA-Fragmentdaten......Page 179
8.4 Kriterien für die Auswahl der Hard- und Software......Page 181
8.4.2 Erweiterbarkeit......Page 182
8.5 Sicherheit der Datenverarbeitung......Page 183
9 Identifizierung von Genen und Markern......Page 184
9.1 Genetische Kartierung......Page 185
9.2 Kartierung von genetischen Markern......Page 187
9.3 Automatisierung der Genotypisierung......Page 189
9.4 Perspektiven der genetischen Kartierung......Page 192
9.5 Literatur......Page 196
10 Polymorphismus- und Mutationsanalyse......Page 198
10.1 Segregationsanalyse gekoppelter polymorpher Marker......Page 199
10.2 Mutationsanalyse......Page 202
10.4 Literatur......Page 208
11.1 Spurenmaterial in Kriminalfällen......Page 210
11.3 Forensisch bedeutsame Polymorphismen......Page 211
11.4.1 Southern-Analyse......Page 213
11.4.2 Polymerase Chain Reaktion (PCR)......Page 214
11.5 Aussichten der VNTR-Typisierung......Page 218
11.6 Weitere Aspekte der DNA-Analyse in der Forensik......Page 219
11.7 Literatur......Page 220
12.1 Einführung......Page 222
12.3 Humanes Immundefizienzvirus......Page 223
12.3.2 Sequenzvariation in der PND des HIV-1/gp120-Oberflächenproteins......Page 225
12.3.3 Bestimmung antiretroviraler Resistenzen gegen HIV-Therapeutika......Page 226
12.4 Hepatitis B-Virus......Page 229
12.5 Resistenzentwicklungen bei bakteriellen Erregern......Page 230
12.7 Literatur......Page 231
13.2 Malignes Hyperthermie-Syndrom beim Schwein (MHS)......Page 234
13.3 Bovine Leukozyten-Adhäsions-Defizienz (BLAD)......Page 236
13.4 Molekularbiologische Bestimmung der Milchproteinvarianten......Page 237
13.6 DNA-Mikrosatelliten-Analyse......Page 238
13.7 Zusammenfassung......Page 241
13.8 Literatur......Page 242
Glossar......Page 244
Sachverzeichnis......Page 250